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アッセイデザイン

T-スポット検査では、インターフェロン-γ遊離反応前に丁寧な前処理(分離・洗浄・標準化)を行い、信頼性の高い結果が得られるようにしています。

● 結果の信頼性を高めるT-スポット検査 3つのステップ ●

T-スポット検査の「分離」

T-スポット検査は、全血そのものではなく、単核球(以下PBMC)を抽出して検査材料とします。検査に必要なPBMCを全血から取り出し、その中のリンパ球が結核菌特異抗原の刺激を受けた結果産生するIFN-γを測るため、血中にある所与のIFN-γ量等の影響を受けない、より特異的な反応に着目した方法です。

例えば、顆粒球が検体中にある場合には、過酸化水素が産生され、T細胞のIFN-γ産生能を抑制するリスクがあります1)2)。T-スポット検査では、検査の対象となるPBMCを全血から「分離」させることで検査中の顆粒球による影響を軽減させることができます。

なお、PBMCの分離は、血中成分の比重の違いを利用する密度勾配遠心法で行います。ただし、採血後、長時間が経過すると、顆粒球の比重が変化し、遠心後のPBMC層に残るリスクがあります。その場合、補助試薬T-Cell Xtend®を加えてから密度勾配遠心法を行うことによって顆粒球を比重の大きい赤血球と連結させ、除去することができます3)

1) McKenna KC, et al. J Immunol Methods. 2009 Feb 28 ; 341(1-2): 68-75
2) Schmielau J, et al. Cancer Res. 2001 Jun 15 ; 61(12): 4756-4760
3) Wang S-H et al. Scand J Infect Dis. 2010 Dec ; 42(11-12): 845-850

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T-スポット検査の「洗浄」

PBMC層を採取した後も、検体中に残存している物質、例えば、治療薬剤などがIFN-γの産生を阻害する可能性4)、あるいは、細胞性免疫を喚起するような物質が残存していることも考えられます。「洗浄」にはこれらの妨害物質を取り除く効果があります。また、非特異的に産生されたIFN-γや抗IFN-γ抗体なども除去することで、特異的に産生されたIFN-γの測定に影響する要素を取り除くことが期待されます。

つまり、「分離」、「洗浄」の工程を経て、検体の純度が高まります。PBMCのIFN-γ産生能を阻害、あるいは喚起するリスクを限りなく軽減して、検査の確実性を保つことを企図したアッセイデザインになっています。

4) Iñiguez MA, Punzón C, Fresno M. J Immunol. 1999 Jul 1 ; 163(1): 111-119

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T-スポット検査の「標準化」

T-スポット検査では、1検体につきPBMC数が100万個となるように数を揃えてから検査を行います。一定量の血液中に存在する白血球の個数には個人差があり、数が異なればIFN-γの産生量にも差が生じると考えられます5)。特に、ステロイド等の服用や、あるいはHIV感染などの病態により、白血球数が減少している患者様も多くいらっしゃいます。こういった、特に発病リスクの高い方々において、誤った検査結果が導かれたり、判定ができなかったりするリスクがあります。

このような患者背景であっても、T-スポット検査は細胞数を標準化することで、同じスタートラインから抗原反応を始めるため、患者背景が検査結果に与える影響を減らすようなアッセイデザインになっています。

また、T-スポット検査は、T細胞から産生されたIFN-γが細胞の形状にスポットとして現れるため、結核菌特異抗原に反応した細胞一つ一つを直接測定できるアッセイデザインになっています。このため、総じて細胞の免疫能が弱い場合であっても、IFN-γが産生されていればスポットは現れるため、IFN-γ産生量の多寡が検査結果に影響を与える可能性は低くなります。

5) Chee CBE, et al. J Clin Microbiol. 2008 Jun ; 46(6): 1935-1940

T-スポット検査は、全血そのものではなく、PBMCを密度勾配遠心法で分離して検査材料とします。

検体中に残存している物質によるIFN-γ産生への影響を限りなく減らし、検査の確実性を保つことを企図したアッセイデザインです。

特に発病リスクの高い方々において、白血球数の不足によりIFN-γが十分検出されない場合などに、誤った検査結果が導かれたり、判定ができなかったりするリスクがあります。

T-スポット検査は細胞数を標準化することで、同じスタートラインから抗原反応を始めるため、患者背景が検査結果に与える影響を減らすようなアッセイデザインになっています。

以上の通り、「分離」「洗浄」「標準化」のステップを経ることで、
細胞性免疫能や血液の状態にみられる個人差を均して、
信頼性の高い結果が得られるようなアッセイデザインになっています。
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